皮膚局部用(yòng)藥泛指應用(yòng)于皮膚表面，使活性成 分(fēn)作(zuò)用(yòng)于皮膚或透過皮膚，産(chǎn)生局部治療作(zuò)用(yòng)的藥 物(wù)。此類藥物(wù)有(yǒu)多(duō)種形式，如軟膏、凝膠、乳膏、 乳液、溶液等，其中(zhōng)半固體(tǐ)劑型使用(yòng)廣泛 [1] 。皮膚 局用(yòng)藥發揮作(zuò)用(yòng)需要經過 4 個步驟 ：①藥物(wù)釋放 ；②藥物(wù)通過滲透或擴散作(zuò)用(yòng)到達目标區(qū)域 ；③激活 預期的藥理(lǐ)作(zuò)用(yòng)，發揮藥效 ；④在目标組織中(zhōng)維持 一定藥物(wù)濃度到一定時間，發揮穩定療效 [2] 。半固 體(tǐ)制劑是複雜、同質(zhì)或異質(zhì)的制劑，藥物(wù)溶解或分(fēn) 散在載體(tǐ)中(zhōng)。其中(zhōng)，分(fēn)散顆粒的大小(xiǎo)和形狀、内相 的液滴大小(xiǎo)、多(duō)态性、各相之間的界面張力、活性 成分(fēn)在各相之間的分(fēn)配系數以及制劑的流變性質(zhì)等 因素共同決定了藥物(wù)的釋放性能(néng)，進而影響藥物(wù)的 安(ān)全性和有(yǒu)效性。美國(guó) FDA 要求仿制藥與原研制 劑 (RLD) 相比必須同時具(jù)有(yǒu)藥學(xué)等效性 (PE) 和生 物(wù)等效性 (BE)。PE 的要求是 ：仿制藥與 RLD 具(jù) 有(yǒu)相同的有(yǒu)效成分(fēn)、含量、劑型，即定性 (Q1) 和定量 (Q2)與RLD相同[3] 。如果仿制藥與RLD相比， Q1 和 Q2 不同，則申請人必須提供充分(fēn)的證據證明 這種差異不會影響該産(chǎn)品的安(ān)全性和藥效。
基于制劑處方的 Q1 和 Q2 等同性，再結合皮 膚局部外用(yòng)制劑微觀結構和體(tǐ)外釋放速率的一緻性 (Q3)，SHAH 等于 2015 年提出了局部用(yòng)藥分(fēn)類系 統 (topical drug classification system，TCS)[4] ，該系 統将皮膚局部外用(yòng)制劑分(fēn)為(wèi) 4 類，如圖 1 所示。如 果仿制藥和 RLD 之間 Q1、Q2 和 Q3 都相同，則 仿制藥可(kě)能(néng)實現生物(wù)等效性豁免 (TCS 1 類 )。在 TCS 理(lǐ)念中(zhōng)，某些輔料可(kě)能(néng)在局部傳遞、發揮作(zuò)用(yòng) 和随之産(chǎn)生的療效中(zhōng)起到積極作(zuò)用(yòng)。但總體(tǐ)來看， 許多(duō)輔料是惰性的。如果仿制藥和 RLD 之間 Q1、 Q2 不同，但在充分(fēn)評估輔料的安(ān)全性和功效後， 可(kě)進行體(tǐ)外釋放試驗 (in vitro release test，IVRT)， 若仿制藥和 RLD 之間的速率比值符合“非無菌半 固體(tǐ)制劑的按比例放大和批準後變更指南 (SUPACSS)”中(zhōng)的确定标準和置信區(qū)間，則可(kě)以實現生物(wù)等 效性豁免 (TCS 3 類 )。若皮膚局部外用(yòng)制劑與參 比制劑的 Q3 不一緻，則不符合生物(wù)等效性豁免條 件，需要進行體(tǐ)内等效性研究 ( 同時包含 TCS 2 類 和 TCS 4 類 )。
圖 1 外用(yòng)制劑在 TCS 中(zhōng)生物(wù)等效性豁免的決策樹 [4]
Fig.1 Decision Tree in Granting Biowaivers for Topical Dosage Forms in TCS[4]
可(kě)見，TCS 肯定了 Q3 在局部給藥制劑開發和産(chǎn)品質(zhì)量評估中(zhōng)的絕對價值。同期研究也表明，Q3 能(néng)充分(fēn)反映物(wù)質(zhì)的微觀結構、物(wù)質(zhì)排列和制劑的聚 集狀态[5—6] ，是制劑性能(néng)的綜合體(tǐ)現。 1 Q3 與體(tǐ)外一緻性評價 早在 1997 年，美國(guó) FDA 就建議使用(yòng) IVRT 方 法進行半固體(tǐ)制劑批準後某些變更的體(tǐ)外一緻性評 價，這些變更包括生産(chǎn)地點或過程變化、藥品成分(fēn) 和組成變化，或批量的變化 [7] 。2012 年，FDA 發 布了《阿昔洛韋乳膏研究指導原則草(cǎo)案》[8] ，首次 明确指出證明生物(wù)等效有(yǒu)體(tǐ)外研究和體(tǐ)内研究 2 種 方案可(kě)供選擇。近年來，FDA 正逐漸接受體(tǐ)外研究 作(zuò)為(wèi)局部仿制藥生物(wù)等效性評估的體(tǐ)内替代方法， 并陸續發布了阿昔洛韋軟膏、甲硝唑乳膏、二十二 醇乳膏、克林黴素磷酸酯凝膠等外用(yòng)制劑仿制藥 開發指導原則 ( 草(cǎo)案 ) [9—12] ，允許仿制藥與參比 制劑在 Q1 和 Q2 一緻的前提下，通過 Q3 相關研 究，即特性表征、IVRT 和體(tǐ)外透皮試驗 ( in vitro permeation test，IVPT) 證明兩制劑的生物(wù)等效性。 在歐盟，如果關于仿制藥質(zhì)量、療效和安(ān)全性 方面的研究均經過充分(fēn)驗證，某些情況下，可(kě)使用(yòng) 動物(wù)或體(tǐ)外研究證明仿制藥與參比制劑的生物(wù)等效 性 [13] 。
2018 年 7 月，我國(guó)藥品審評中(zhōng)心 (CDE) 發布了《新(xīn)注冊分(fēn)類的皮膚外用(yòng)仿制藥的技(jì )術評價要求 ( 征求意見稿 )》[14] ，體(tǐ)外等效性評價方法中(zhōng)明确規 定 ：半固體(tǐ)制劑 ( 如乳膏劑、軟膏劑、凝膠劑等 ) 在主要質(zhì)量特性一緻的基礎上，可(kě)通過體(tǐ)外釋放對 比和透皮吸收對比試驗來評價仿制藥和參比制劑的 質(zhì)量和療效的一緻性。如二者體(tǐ)外釋放及體(tǐ)外透皮 吸收均一緻，可(kě)不要求進行非臨床研究和臨床試驗。
不難看出，國(guó)内外藥品監管機構對體(tǐ)外一緻 性的評價考慮不盡相同，但伴随對皮膚局部外用(yòng)仿 制藥審評要求的深入認知，各監管機構均傾向于與 FDA 保持一緻，即對于局部外用(yòng)仿制藥，僅保證 PE是不夠的，應保持最大程度的Q1、Q2 和Q3 等同。 《皮膚外用(yòng)化學(xué)仿制藥研究技(jì )術指導原則 ( 試行 )》 中(zhōng)明确指出，在有(yǒu)充分(fēn)的依據證明仿制藥與 RLD 的 Q1 和 Q2 一緻，且 Q3 也一緻的情況下，可(kě)基于 國(guó)外先進監管機構對該具(jù)體(tǐ)品種的生物(wù)等效性指南 相關要求，提出臨床豁免申請 [15] 。
2 Q3 等同性研究的考察内容 基于文(wén)獻綜述 [16] ，Q3 等同性比較包括 ：物(wù) 理(lǐ)化學(xué)特性 (physicochemical characterization) 的可(kě) 比性、物(wù)理(lǐ)和結構的相似性 (physical and structural similarity)、物(wù)化或微觀結構特性 (physicochemical/ microstructural characterization) 的可(kě)比性。 結合國(guó)内外監管機構相關指導原則要求，常規 皮膚外用(yòng)制劑 Q3 考察的質(zhì)量屬性一般包括但不限 于以下項目：外觀、藥物(wù)晶型、粒度分(fēn)布、液滴粒徑、 流變特性、pH 值、黏度、含量均勻度、IVRT 和 IVPT 等。其中(zhōng)，流變學(xué)、黏度、粒徑、晶型或晶 癖表征等均屬于 Q3 的關鍵質(zhì)量屬性 (critical quality attribute，CQA) ；IVRT、IVPT 評價則能(néng)顯示出仿 制藥與 RLD 的制劑功能(néng)特征差異。以下将簡單闡 述 Q3 中(zhōng)的 CQA 研究項目、IVRT 和 IVPT 的方法 開發及驗證要求。
3 技(jì )術要點解析
3.1 流變學(xué)試驗方法的建立與方法學(xué)研究
半固體(tǐ)制劑的流變學(xué)性質(zhì)是産(chǎn)品關鍵物(wù)料屬性 (critical material attribute，CMA) 和關鍵工(gōng)藝參數 (critical process parameter，CPP) 的綜合結果，反映了制劑的微觀結構，對藥物(wù)從制劑中(zhōng)的釋放、皮膚 滲透以及皮膚滞留有(yǒu)重要影響，還影響制劑穩定性 和患者順應性 [3,17—18] 。因此在半固體(tǐ)制劑的仿制藥 開發中(zhōng)，流變學(xué)在保證産(chǎn)品質(zhì)量和保持與原研制劑 的一緻性方面起着關鍵作(zuò)用(yòng)。FDA 自 2016 年發布 《阿昔洛韋乳膏研究指導原則草(cǎo)案》後，陸續發布 了多(duō)個特定的局部外用(yòng)半固體(tǐ)制劑的仿制藥開發指 南，其中(zhōng)理(lǐ)化性質(zhì)及微觀結構對比部分(fēn)均包含了流 變學(xué)行為(wèi)的表征。EMA 于 2018 年發布的《局部外 用(yòng)産(chǎn)品質(zhì)量和等效性指南》中(zhōng)建議的流變學(xué)評價方 式與 FDA 相似，此外在擴展藥學(xué)等效接受标準中(zhōng) 做了限度規定。CDE 于 2021 年 3 月發布的《皮膚 外用(yòng)化學(xué)仿制藥研究技(jì )術指導原則 ( 試行 )》中(zhōng)亦 指出，應參考上述指導原則，對仿制藥與參比制劑 的流變特性 ( 包括剪切應力與剪切速率的完整流動 曲線(xiàn)、屈服應力和蠕變試驗、線(xiàn)性黏彈性響應 ) 進 行對比研究。主流監管機構對流變學(xué)的研究内容要 求如表 1 所示。
| FDA | ①對于剪切應力相對于剪切速率和黏度相對于剪切速率的表征，至少應該包括3種剪切速率(低、中(zhōng)、高)下的黏度數據，并包括可(kě)及剪 切速率範圍内的完整流動曲線(xiàn)，直到識别出低或高剪切平台(如有(yǒu)可(kě)能(néng)) |
| ②如果被測材料表現出塑性流動行為(wèi)，應報告屈服應力值 | |
| ③應測量和報告線(xiàn)性黏彈性響應(儲能(néng)模量和損耗模量相對于頻率的表征) | |
| EAM | ①剪切應力(或黏度)相對于剪切速率的完整流動曲線(xiàn)，包括剪切速率增加和減少範圍内的多(duō)個數據點，以便清楚地識别曲線(xiàn)上升或下 降段的任何線(xiàn)性部分(fēn)；所得到的曲線(xiàn)應通過(修正的)幂律方程來表征，以便産(chǎn)生數值數據 |
| ②屈服應力和蠕變 | |
| ③線(xiàn)性黏彈性響應(儲能(néng)模量和損耗模量相對于頻率的表征) | |
| 如：黏度曲線(xiàn)上特定剪切速率下的黏度(如100 s–1 對應的黏度)；塑性流動的屈服應力值；觸變相對面積；儲能(néng)模量和損耗模量；表觀 黏度；損耗因子(tanδ) | |
| ⑤應測定至少3批受試和原研制劑的上述參數，每批至少重複12次；一緻性标準為(wèi)：受試和參比制劑均值之差的90％置信限應不超過參 比制劑均值可(kě)接受限度的±10％，假定數據呈正态分(fēn)布 | |
| CDE | ①剪切應力相對于剪切速率的完整流動曲線(xiàn) |
| ②屈服應力和蠕變試驗 | |
| ③線(xiàn)性黏彈性響應 |
表 1 FDA、EMA 以及 CDE 對局部外用(yòng)半固體(tǐ)制劑仿制藥流變學(xué)研究内容的闡述
Tab.1 Guidelines on Rheological Behavior Characterization of Generic Topical Semisolid Drug Products by FDA, EMA and CDE
3.1.1 方法開發要點
盡管已有(yǒu)較多(duō)關于半固體(tǐ)制劑流變學(xué)測定的文(wén) 獻報道，但測定方法仍缺乏标準化開發和驗證程序， 且流變學(xué)參數有(yǒu)多(duō)種定義和表征方式。以下将對指 導原則中(zhōng)主要流變學(xué)參數和要求進行相應的要點 闡述。
流動曲線(xiàn) (flow curve) 一般使用(yòng)速率控制型儀 器進行測定，在一定溫度下，控制剪切速率在一定 範圍内變化，記錄黏度或剪切應力的響應，通常繪 制剪切應力或黏度相對于剪切速率的雙對數曲線(xiàn)， 可(kě)更清楚地展現屈服應力及流動特性的變化[3,19] 。
通常采用(yòng)流動掃描 (flow sweep) 測量模式獲得 完整的穩态流動曲線(xiàn)。剪切速率的設定範圍應充分(fēn) 考慮産(chǎn)品貯存和使用(yòng)時可(kě)能(néng)經曆的受力程度，如将 制劑從内包裝(zhuāng)容器中(zhōng)擠出或塗布于皮膚上時，所施 加的力因人而異，因此在儀器扭矩允許情況下盡量 選取較寬的剪切速率範圍，如 10–4 或 10–3 s –1 至 100 s–1 。在低和高剪切速率下，制劑分(fēn)别處于幾 乎不流動和類似牛頓流體(tǐ)流動狀态時，以黏度為(wèi)響 應的流動曲線(xiàn)會呈現平台段 ( 應力對應變的曲線(xiàn)為(wèi)線(xiàn)性 )。對于無法測得平台段的制劑，如内部結構 較松散的半固體(tǐ)制劑在很(hěn)小(xiǎo)的剪切速率下即開始流 動 [20] ，穩态流動曲線(xiàn)可(kě)能(néng)無法确定流動起始點， 此時可(kě)采用(yòng)流動斜坡 (flow ramp) 測量模式并結合 其他(tā)流變參數進行表征。
受試和參比制劑的流變特性可(kě)通過比較流動曲 線(xiàn)的形狀及特定剪切速率下的黏度來評價。結合制 劑本身的性質(zhì)和貯存、使用(yòng)情況，應在設定的剪切 速率範圍内選擇低、中(zhōng)和高剪切速率對應黏度值 ： 低到中(zhōng)剪切速率下的黏度與制劑從包裝(zhuāng)材料中(zhōng)被擠 出的難易程度相關，中(zhōng)到高剪切速率下的黏度則 與制劑使用(yòng)時的塗展性有(yǒu)關 [21] 。例如設定範圍為(wèi) 10–4 ～ 100 s–1 時，宜選擇 0.001、1 和 56 s–1 作(zuò)為(wèi) 低、中(zhōng)和高剪切速率，将對應的黏度值與參比制劑 進行比較 [22] 。根據 EMA 指導原則的要求，應力對 剪切速率的流動曲線(xiàn)應包含剪切速率增加和減少的 部分(fēn)，即剪切速率從低到高、再從高到低階段産(chǎn)生 的上升和下降段的流動曲線(xiàn)。“上”“下”曲線(xiàn)形成 的回環通常被稱為(wèi)“觸變環”[23] 。觸變環面積是制 劑觸變性的度量，因此通過比較觸變環的輪廓和面 積可(kě)評估受試和參比制劑内部結構的相似性。
屈服應力 (yield stress) 是指制劑開始流動的臨 界應力。在該值以下，制劑主要呈現彈性性質(zhì)，高 于該值時制劑呈塑性流動。屈服應力可(kě)反映制劑的 貯存穩定性并決定了患者使用(yòng)時的感官特性。半固體(tǐ)制劑的屈服應力應足夠大，從而防止自身質(zhì)量引 起的流動，但同時也不應過大而難以在皮膚上塗抹 均勻。屈服應力可(kě)通過不同的測量方式獲得，主要 有(yǒu)以下幾種表征形式，見表 2。其中(zhōng)，線(xiàn)性黏彈響 應和剪切應力 - 剪切速率曲線(xiàn)較為(wèi)常用(yòng)。還可(kě)采用(yòng) 剪切應力的平方根對剪切速率的平方根繪制曲線(xiàn) (Casson 曲線(xiàn) ) 或剪切應力對剪切速率的平方根繪 制曲線(xiàn) (Fitch 曲線(xiàn) )，可(kě)更直觀地獲得屈服應力值。
測量方法 | 取值方式 |
穩态流動曲線(xiàn) (黏度-應力) | 通過曲線(xiàn)上發生塑性流動時過渡區(qū)的交點确定 |
線(xiàn)性黏彈響應 | 儲能(néng)模量-應力曲線(xiàn)的起始點(onset point) 對應的應力 |
儲能(néng)模量-應力曲線(xiàn)和損耗模量-應力曲線(xiàn)的 交點對應的應力 | |
剪切速率-剪切應力曲線(xiàn) | 曲線(xiàn)的垂直段對應的應力 |
剪切應力-剪切速率曲線(xiàn) | 對曲線(xiàn)進行線(xiàn)性回歸，所得方程的截距 雙對數曲線(xiàn)的切線(xiàn) |
表 2 屈服應力的不同測量方式
Tab.2 Measurement Methods of Yield Stress
蠕變測試 (creep test ) 是考察半固态物(wù)質(zhì)黏彈 性最簡單的方法之一。一定溫度下，突然對制劑 施加一個應力 (σ )，并在随後一段時間内保持不 變，柔量 ( J= 應變 / 應力，單位為(wèi) Pa–1 ) 随時間變 化的曲線(xiàn)稱為(wèi)蠕變曲線(xiàn)，應力消除後一段時間内的 柔量 ( JR)- 時間曲線(xiàn)稱為(wèi)蠕變恢複曲線(xiàn)。圖 2 為(wèi)黏 彈性物(wù)質(zhì)典型的蠕變曲線(xiàn)，零時刻 (t=0) 瞬時增大的柔量 ( J0，可(kě)表示為(wèi)瞬時模量 G0 的倒數 ) 代表彈 性結構的破壞 (rapid elastic response)，随後柔量 J 随時間延長(cháng)而緩慢增加，代表進一步的結構破壞和 重整 (retarded response)，達到一定時間後，J 與時 間成線(xiàn)性，代表結構在該應力下達到穩态 (steady state)。達到穩态後撤去應力，結構的彈性部分(fēn)恢複， 蠕變恢複曲線(xiàn)呈現下降趨勢，結構越接近完全恢複， 則 JR 值越小(xiǎo)。蠕變測試中(zhōng)設定的應力如小(xiǎo)于屈服應 力，則柔量隻是時間的函數，與所施加的應力大小(xiǎo) 無關 [24] ；如設定的應力大于屈服應力則結構會發 生不可(kě)逆破壞，表現為(wèi)蠕變曲線(xiàn)急劇上升。蠕變測 試設定的時間長(cháng)度應持續至達到穩态 ；可(kě)直接比較 受試和參比制劑的蠕變曲線(xiàn)，或者特定時間點的柔 量值。
圖 2 黏彈性體(tǐ)系的典型蠕變 / 恢複曲線(xiàn) [25]
Fig.2 Typical Creep/Recovery Curve for a Viscoelastic System[25]
線(xiàn)性黏彈性響應 (linear viscoelastic response) 是指通過振蕩測試 (oscillation test) 可(kě)考察的半固 體(tǐ)制劑的黏彈性質(zhì)。振蕩測試可(kě)以各種形式進行， 如應變或扭矩 ( 應力 ) 掃描、頻率掃描、溫度掃描 和時間掃描。以應變掃描為(wèi)例，在特定溫度下，固 定頻率 ( 通常為(wèi) 0.1 或 1 Hz) 後測量黏彈性參數作(zuò) 為(wèi)應變的函數。在臨界應變以下，動态黏度、儲能(néng) 模量 (G')、損耗模量 (G'') 與時間 ( 或頻率 ) 成線(xiàn) 性關系，該區(qū)域通常被稱為(wèi)線(xiàn)性黏彈性區(qū)域 (linear viscoelastic region，LVR)。在該區(qū)域内，對微觀結 構的擾動可(kě)瞬間恢複 ( 可(kě)逆過程 )。當應變超過臨 界應變，結構開始被破壞，不再成線(xiàn)性關系。
3.1.2 方法學(xué)驗證
目前流變學(xué)測定方法尚無标準化驗證程序。 SIMÕES等用(yòng)1％氫化可(kě)的松乳膏作(zuò)為(wèi)模型産(chǎn)品[26] ， 嘗試系統地驗證試驗裝(zhuāng)置和測量方法，包括精(jīng)密度、 區(qū)分(fēn)力和耐用(yòng)性 ：①流變儀的驗證，在 25 和 32 ℃ 下測定參考标準物(wù) ( 牛頓流體(tǐ) ) 的黏度分(fēn)布，RSD 小(xiǎo)于 15％ ；②日間精(jīng)密度試驗，在不同的 3 日内進 行 12 次流變測量，RSD 小(xiǎo)于 15％；③區(qū)分(fēn)力試驗， 交叉比較含不同比例關鍵輔料以及不同制備工(gōng)藝制 得制劑的流變學(xué)性質(zhì)，如有(yǒu)顯著差異，則表明方法 具(jù)有(yǒu)區(qū)分(fēn)力；④耐用(yòng)性試驗，比較不同溫度 (±2 ℃ )、 不同上樣方式 ( 注射器或刮刀(dāo) ) 以及不同模具(jù) ( 錐闆或平行闆 ) 下所得的數據，與标稱方法所得平均 值的偏差小(xiǎo)于 15％時可(kě)認為(wèi)方法具(jù)有(yǒu)耐用(yòng)性。
圖 2 黏彈性體(tǐ)系的典型蠕變 / 恢複曲線(xiàn) [25] Fig.2 Typical Creep/Recovery Curve for a Viscoelastic System[25]
3.2 藥物(wù)晶型及有(yǒu)關參數
皮膚外用(yòng)制劑的療效與藥物(wù)在制劑中(zhōng)的存在形 式密切相關，因此活性藥物(wù)成分(fēn) (API) 的粒徑及分(fēn) 布、晶型、晶癖、在各輔料中(zhōng)的溶解度和分(fēn)布均為(wèi) 皮膚外用(yòng)制劑的研究重點。藥物(wù)的晶型決定了穩定 性、溶解度、生物(wù)利用(yòng)度等理(lǐ)化性質(zhì)，是直接影響 制劑臨床療效和安(ān)全性的重要因素 [27] 。
對于難溶性藥物(wù)、混懸型半固體(tǐ)制劑而言，隻 有(yǒu)分(fēn)子态 API 才能(néng)進入病竈部位發揮療效，因此 API 晶型和晶癖是制劑質(zhì)量控制的 CQA 指标。常 規而言，監測混懸劑中(zhōng)固體(tǐ) API 的晶型變化及粒度 分(fēn)布時，需采用(yòng)特定的處理(lǐ)技(jì )術來獲得固态的 API， 首選粉末 X 射線(xiàn)衍射法 (powder X-ray diffraction， PXRD) 來研究 API 晶型。但皮膚外用(yòng)半固體(tǐ)制劑 中(zhōng)藥物(wù)的含量較低，可(kě)能(néng)無法檢出相應的 PXRD 響 應 ；同時，此類制劑與傳統的結晶固體(tǐ)不同，藥物(wù) 均勻分(fēn)布在油脂性或水溶性基質(zhì)中(zhōng)，大多(duō)呈現無定 形态。利用(yòng)共聚焦拉曼光譜技(jì )術 (confocal Raman spectroscopy)，可(kě)以定位到半固體(tǐ)制劑中(zhōng)的 API， 直接采集對應位置處的信号，同時可(kě)減少其他(tā)附加 劑的幹擾。拉曼光譜技(jì )術無需樣品制備，屬于對樣品無損的原位檢測技(jì )術。鑒于這些獨特的優勢，拉 曼光譜可(kě)為(wèi)半固體(tǐ)制劑晶型問題的研究提供更為(wèi)廣 闊的思路和角度 [28] 。
3.3 微觀結構與粒子尺度
通過查閱 RLD 的上市資料及逆向工(gōng)程，可(kě)以 确定參比制劑中(zhōng)的組分(fēn)種類及相關物(wù)化特性。若能(néng) 清楚了解 RLD 中(zhōng) API 及輔料的分(fēn)布方式、産(chǎn)品的 分(fēn)層情況，則可(kě)倒推出制劑的大緻生産(chǎn)工(gōng)藝。乳膏 劑、乳劑産(chǎn)品為(wèi)包含油、水兩相的熱力學(xué)不穩定體(tǐ) 系，制劑的液滴粒徑等指标反映了處方工(gōng)藝的合理(lǐ) 性，并可(kě)能(néng)會影響到藥物(wù)的釋放性能(néng)和經皮遞送效 果。特别是對于微米、納米尺度的乳膏劑和乳劑産(chǎn) 品，液滴粒徑和分(fēn)布對其質(zhì)量和藥效發揮具(jù)有(yǒu)重要 影響。
在半固體(tǐ)制劑微觀結構的表征和粒子尺度的測 定中(zhōng)，遇到的最大挑戰是需要開發一種合适的樣品 制備技(jì )術，以滿足以下要求 ：①能(néng)嚴格區(qū)分(fēn)粒子或 液滴與制劑中(zhōng)的其他(tā)組分(fēn)，以便得到準确的微粒計 數 ；②樣品制備過程中(zhōng)的稀釋、蒸發或其他(tā)操作(zuò)不 改變粒子或液滴原本的分(fēn)布 [29] 。
運用(yòng)較多(duō)的檢測技(jì )術包括光學(xué)顯微方法、形 态定向拉曼光譜 (morphologically-directed Raman spectroscopy，MDRS)、動态光散射 (DLS) 和激光 衍射 (LD)。其中(zhōng)，光學(xué)顯微方法和 MDRS 法的測 量範圍為(wèi) 1 ～ 1 000 µm ；DLS、LD 方法分(fēn)别适用(yòng) 于測定 10 nm 至 10 µm、10 nm 至 1 mm 微粒的尺 寸和分(fēn)布。表 3 總結了上述檢測技(jì )術的優勢、局限 和應用(yòng)場景。在制劑工(gōng)藝開發過程中(zhōng)，如果單一技(jì ) 術不能(néng)準确地測定整體(tǐ)粒度分(fēn)布，那麽就需要 2 種 或多(duō)種技(jì )術聯用(yòng)，以完全确定描述局部用(yòng)藥的微觀 結構和粒子尺度特性。
3.4 IVRT IVRT
可(kě)以反映半固體(tǐ)藥品物(wù)理(lǐ)化學(xué)性質(zhì)的 變化，釋藥速度和程度是制劑性能(néng)的綜合體(tǐ)現。 IVRT 包括流通池 (flow through cell) 法、Franz 擴 散池 (diffusion cells) 法、動态浸泡細胞 (immersion cells) 法、改良的半固體(tǐ)容納法、槳碟法等。其中(zhōng)， Franz 擴散池法最為(wèi)簡便和實用(yòng)，因此通常用(yòng)于外用(yòng)制劑的藥學(xué)質(zhì)量控制，也可(kě)用(yòng)于藥品開發過程 中(zhōng)處方工(gōng)藝的篩選研究。可(kě)參考 USP 42 一般章節 <1724> 半固體(tǐ)藥物(wù)産(chǎn)品——性能(néng)測試中(zhōng)的通用(yòng)操 作(zuò)和方法，比較仿制藥和RLD産(chǎn)品之間藥物(wù)釋放率。 以下對 IVRT 的方法開發和數據統計進行相應的要 點闡述。
3.4.1 IVRT 的方法要點
IVRT 方法要點如表 4 所述，總體(tǐ)要求是能(néng)夠 區(qū)分(fēn)類似制劑中(zhōng)藥物(wù)釋放速率的差異。IVRT 方法 的區(qū)分(fēn)能(néng)力可(kě)以用(yòng)下述 3 個概念來描述 [9] 。①靈 敏度 ：IVRT 的靈敏度是指監測釋放率變化的能(néng)力， 與制劑中(zhōng)藥物(wù)的濃度相關 ；②特異性 ：IVRT 特異 性是指能(néng)夠準确監測釋放速率與制劑中(zhōng)藥物(wù)濃度呈 比例變化的能(néng)力 ；③選擇性 ：IVRT 選擇性是指具(jù) 有(yǒu)足夠的識别能(néng)力，能(néng)區(qū)分(fēn)因處方中(zhōng)藥物(wù)濃度的不 同、影響質(zhì)量的輔料成分(fēn)的改變及關鍵工(gōng)藝參數的 變更而導緻的釋放速率差異。
| 檢測技(jì )術 | 測量範圍 | 主要優勢 | 局限性 | 應用(yòng) | 依據 |
| 手動光學(xué)顯 微鏡(明場 顯微鏡) | 1～1 000 µm | 1．樣品用(yòng)量少； | 1．分(fēn)辨率約為(wèi)1 μm； | 1．是半固體(tǐ)制劑微觀結構和形态 分(fēn)析中(zhōng)使用(yòng)最廣泛的工(gōng)具(jù)； | 美國(guó)藥典(USP 42)一 般要求<776>光學(xué)顯 微鏡檢查和文(wén)獻[30] |
| 2． 可(kě)表征非球形顆粒； | 2．如果存 在部分(fēn)微米尺寸的顆粒或液滴， 則總體(tǐ)粒度分(fēn)布将出現誤差 | 2．适用(yòng)于觀察液滴大小(xiǎo)的變化和多(duō)分(fēn) 散性等微觀結構變化； | |||
| 3．校準精(jīng)度可(kě)驗證 | 3．形态觀 察可(kě)反映潛在的物(wù)理(lǐ)穩定性 | ||||
| 手動光學(xué)顯 微鏡(偏光 顯微鏡) | 1～1 000 µm | 适用(yòng)于晶體(tǐ)藥物(wù) | 對于非晶體(tǐ)非光折射的顆粒 檢測能(néng)力有(yǒu)限 | 1．識别未溶解或沉澱的 API； | 文(wén)獻[31] |
| 2．可(kě)觀察具(jù)有(yǒu)雙折射圖案的 液晶乳液 | |||||
| 自動光學(xué) 顯微鏡 | 1～1 000 µm | 1．高效形态掃描； | 不能(néng)測量小(xiǎo)于 1 μm的顆粒或 液滴 | 藥典方法的補充 | USP 42 <788>注射液 中(zhōng)的顆粒物(wù) |
| 2．消除人為(wèi)誤差； | |||||
| 3．統計穩健性較高 | |||||
| MDRS | 1～1 000 µm | 1．高速掃描識别； | 适用(yòng)于半定量分(fēn)析 | 1．是自動顯微鏡和拉曼光譜的結 合； | 文(wén)獻[32] |
| 2．對樣品制備要求 低； | 2．具(jù)有(yǒu)強大的數據庫，可(kě)進 行數據檢索； | ||||
| 3．對水不敏感， 具(jù)有(yǒu)高化學(xué)特異性 | 3．可(kě)為(wèi)微米尺度粒 子的定性提供足夠的信噪比 | ||||
| DLS | 10 nm至10 µm | 快速、可(kě)重複、穩健 | 1．不适合具(jù)有(yǒu)黏性或微結構化配 方的劑型； | 适用(yòng)于微米或納米尺度的粒子測 定，要求樣品具(jù)有(yǒu)良好的流動性 | — |
| 2．含有(yǒu)微結構的樣 品需要充分(fēn)稀釋以通過儀器流通 池，會導緻粒度和粒度分(fēn)布數據 失真 | |||||
| LD | 10 nm至1 mm | 1．快速、可(kě)重複、穩 健； | 1．樣品需稀釋以保證具(jù)有(yǒu)足夠的 流動性； | 适用(yòng)于微米或納米尺度的粒子測 定，要求樣品具(jù)有(yǒu)良好的流動性 | 文(wén)獻[33] |
| 2．需要的樣品量 很(hěn)少 | 2．LD 模型假設粒子是 球形的，因此當顆粒形狀呈現非 球形時，準确度降低 |
3 不同檢測技(jì )術的優勢、局限和應用(yòng)的總結
Tab.3 Summary of Advantages, Limitations and Applications of Different Detection Techniques
| 考察項目 | 考慮要點 |
| 設備和參數 | 選擇依據；産(chǎn)品劑量；取樣次數；攪拌速度 |
| 膜的選擇 | 膜的種類 ；API 與膜和接收介質(zhì)的化學(xué)兼容性 ；API 與膜的吸附作(zuò)用(yòng) |
| 接收介質(zhì)的篩選 | 提供藥物(wù)在接收介質(zhì)中(zhōng)的溶解性和穩定性數據；考察接收介質(zhì)的反相滲透 |
| 精(jīng)密度和重現性 | 日内與日間精(jīng)密度各測定3次，要求變異系數≤15％ |
| 耐用(yòng)性 | 對方法參數 ( 如溫度和攪拌速度 ) 的變化、接收介質(zhì) ( 組成或 pH 值 ) 的變化進行驗證，若所得平均釋放速率的變異系數 在 ± 15％範圍内，則可(kě)認為(wèi)方法具(jù)有(yǒu)耐用(yòng)性 |
| 樣品分(fēn)析方法的驗證 | 驗證方案應符合現行 FDA 生物(wù)分(fēn)析方法驗證行業指南或滿足 ICH 三方協調指導原則 ：分(fēn)析方法論證 Q2(R1) 的相關要求 |
| 數據統計 | 理(lǐ)論依據：Higuchi方程，建議相關系數r2 ≥ 0.90 |
表 4 IVRT 方法要點
Tab.4 Main Points of IVRT Methods
3.4.2 IVRT 的數據統計
體(tǐ)外釋放數據比較應該分(fēn) 2 步進行。第一階段， 體(tǐ)外釋放設備 (6 個擴散池 ) 應該運行 2 次，參比 制劑 (R) 和受試制劑 (T) 各産(chǎn)生 6 個斜率 [7,14] ，依 據 Higuchi 方程，該斜率即為(wèi)制劑的釋放速率。計 算 T/R 中(zhōng)藥物(wù)的釋放速率比值。當總體(tǐ)樣本為(wèi) 36 時，根據中(zhōng)位數置信區(qū)間的百分(fēn)位專用(yòng)公(gōng)式計算得 到 90％置信區(qū)間的上限所在位次為(wèi)第 29 位，置信 區(qū)間下限所在位次為(wèi)第 8 位。把 T/R 的比值數值按 從小(xiǎo)到大的順序排列，如果 90％置信區(qū)間的計算結 果在 75％～ 133.33％的限度範圍内，則視為(wèi) T 與 R 等效。
如果第一階段測試不合格，則應該增加 4 次體(tǐ) 外設備 (6 個擴散池 ) 的運行，T 和 R 各增加 12 個 斜率，或共 18 個斜率 ( 即包括第一階段的結果 )。 計算 T 和 R 的中(zhōng)位體(tǐ)外釋放率比值的 90％置信區(qū) 間，如計算結果在 75％～ 133.33％範圍内，則認為(wèi) 通過了第二階段測試。
3.5 IVPT
IVPT 被廣泛被用(yòng)于皮膚外用(yòng)半固體(tǐ)制劑處方 和工(gōng)藝研究中(zhōng)，用(yòng)以考察仿制藥或處方工(gōng)藝變更後産(chǎn)品與 RLD 在透皮吸收程度的差異。然而，FDA、 EMA 或 CDE 均尚未建立标準化的 IVPT 方法開發 和驗證程序，以下将重點參考 FDA《阿昔洛韋乳 膏研究指導原則草(cǎo)案》、EMA《局部外用(yòng)産(chǎn)品質(zhì)量 和等效性指南》、CDE《皮膚外用(yòng)化學(xué)仿制藥研究 技(jì )術指導原則 ( 試行 )》，結合文(wén)獻研究内容，對 IVPT 的研究内容進行總結歸納，詳見表 5。
3.5.1 IVPT的方法開發要點
本課題組緻力于經皮給藥新(xīn)技(jì )術的開發和制劑 研究，在皮膚模型的建立、篩選及皮膚的質(zhì)控方面 積累了豐富的經驗。豬皮模型中(zhōng)藥物(wù)的滲透性較接近人體(tǐ)皮膚，因而具(jù)有(yǒu)一定的臨床預測價值。但由 于皮膚的差異較大，皮膚的取樣部位、新(xīn)鮮度、厚 度和水分(fēn)均會影響其滲透性。對影響皮膚滲透性的 關鍵屬性進行研究，可(kě)以實現皮膚源頭的質(zhì)量控制， 從而提高 IVPT 方法的準确性以及重現性。IVPT 方 法要點總結見表 6。
IVPT 方法的區(qū)分(fēn)能(néng)力可(kě)以用(yòng)下述的 2 個概念 來描述 ：靈敏度和選擇性 [9] 。①靈敏度是指 IVPT 方法具(jù)有(yǒu)監測藥物(wù)皮膚藥代動力學(xué)變化的能(néng)力，與 藥物(wù)遞送系統相關。如果在 IVPT 方法中(zhōng)，透皮速 率曲線(xiàn)的變化趨勢與藥物(wù)劑量的變化趨勢一緻，則可(kě)認為(wèi)該方法敏感。②在 IVPT 方法研究中(zhōng)，除應 評估受試産(chǎn)品和 RLD 外，還應使用(yòng)已上市或單獨 設計的第三種産(chǎn)品或配方進行平行評估，研究結果 可(kě)作(zuò)為(wèi)該方法具(jù)有(yǒu)選擇性的數據支持。
3.5.2 IVPT 的數據統計
以 Flux 或 J 相對于時間繪圖，可(kě)得到經皮滲透 速率曲線(xiàn)，Jmax 記為(wèi)最大經皮滲透速率。同時，用(yòng) A 相對于時間繪圖，可(kě)得到藥物(wù)的累積透過量曲線(xiàn)， Atotal 定義為(wèi)試驗結束時的總滲透量。
應排除具(jù)有(yǒu)高變異性的制劑。FDA 和 EMA 相關指導原則中(zhōng)通常認為(wèi)等效性的區(qū)間範圍應為(wèi) 80％～ 125％。其中(zhōng)，EMA 還要求提供 Atotal、皮膚 樣品中(zhōng)滞留的藥物(wù)總量 (Stotal) 和清潔或試驗設備上 保留的藥物(wù)量 (Rtotal)，藥物(wù)的總回收率應為(wèi) 90％～ 110％，以确定達到質(zhì)量平衡。
參考 CDE《新(xīn)注冊分(fēn)類的皮膚外用(yòng)仿制藥的技(jì ) 術評價要求 ( 征求意見稿 )》，IVPT 的試驗結果以 平均滲透率作(zuò)為(wèi)判定仿制藥和 RLD 相似性的依據， 在規定的試驗時間或滲透率達到平穩後的 1 個時間點和同一時間點滲透一半速率的時間點，若試驗制 劑滲透率的變動等于或小(xiǎo)于參比制劑滲透率的變 動，且仿制藥與RLD的平均滲透率之比為(wèi)0.7～1.3， 則視為(wèi)二者等效。同時要求計算單位質(zhì)量皮膚内的 藥物(wù)含量 ( 皮内滞留量 ) 并進行比對。
IVPT 的設計初衷是模拟局部外用(yòng)制劑中(zhōng) API 在生理(lǐ)條件下的經皮滲透過程，實際研究中(zhōng)應綜合 參考國(guó)内外相關的指導原則要求，還需結合産(chǎn)品劑 型特點、作(zuò)用(yòng)部位和藥效機制，進行科(kē)學(xué)全面的評 估，以保證測定結果準确可(kě)靠。
| 内容 | FDA/EMA | CDE |
| 裝(zhuāng)置 | Franz 擴散池、流通池 | Franz 擴散池 |
| 目的 | 模拟仿制藥與 RLD 中(zhōng) API 在生理(lǐ)條件下的經皮滲透行為(wèi)，可(kě)為(wèi)二者生物(wù)等效 提供依據 | 模拟仿制藥與 RLD 中(zhōng) API 在生理(lǐ)條件下的經皮滲透行為(wèi) |
| 皮膚類型 | 離體(tǐ)的人體(tǐ)皮膚 | 參考國(guó)外指導原則 |
| 介質(zhì)種類 | 生理(lǐ)性介質(zhì) | 水或緩沖液，不使用(yòng)有(yǒu)機溶劑，但可(kě)添加表面活性劑 |
| 例數 | FDA ：僅規定預試階段每個皮膚供體(tǐ) n ≥ 4，正式研究依據預試結果确定 | ≥ 6 個 |
| EMA ：皮膚供體(tǐ)數量 n ≥ 12，每個供體(tǐ)至少重複 2 次 | ||
| FDA ：非零采樣時間點≥ 8 個 | ||
| 采樣頻率 | EMA ：推薦 24 h 為(wèi) 1 個試驗周期，采樣時間點的數量應該足以獲得完整的經 皮滲透曲線(xiàn) | ≥5個 |
| 研究意義 | ①證明仿制藥與 RLD 生物(wù)等效 ；②研究結果可(kě)預測體(tǐ)内外相關性 [7,10] | 比較仿制藥與 RLD 經皮滲透行為(wèi) |
| 研究評價 | 研究階段包含預試和正式研究，正式階段應按 BE 研究相關規定執行 | 體(tǐ)外試驗 |
表 5 FDA、EMA 及 CDE 對局部外用(yòng)半固體(tǐ)制劑仿制藥 IVPT 研究内容的闡述
Tab.5 Guidelines on IVPT of Generic Topical Semisolid Drug Products by FDA, EMA and CDE
| 考察項目 | 考慮要點 |
| 設備 | 包括垂直擴散池和流通池的裝(zhuāng)置 ；應使用(yòng)廠家提供的安(ān)裝(zhuāng)方法 ；操作(zuò)和性能(néng)校驗的相關程序 |
| 參數 | 選擇依據 ；産(chǎn)品劑量 ；取樣次數 ；攪拌速度 |
| 皮膚模型選擇 | 建議将豬皮作(zuò)為(wèi) IVPT 研究中(zhōng)的模型，但應對皮膚進行适當質(zhì)控 |
| 接收介質(zhì)的篩選 | 提供藥物(wù)在接收介質(zhì)中(zhōng)的溶解性和穩定性數據 ；IVPT 超過 24 h ，需證明試驗過程中(zhōng)皮膚屏障的完整性 |
| 樣品分(fēn)析方法的驗證 | 建議滿足生物(wù)分(fēn)析方法驗證的相關要求 |
| 滲透參數 | 單位面積滲透速率 (Flux 或 J) ：單位面積累積滲透量 (A) ：單位面積透過皮膚的藥物(wù)量 |
表 6 IVPT 方法要點
Tab.6 Main Points of IVPT Methods
4 總結
本研究參考國(guó)内外相關技(jì )術指導原則及文(wén)獻， 對皮膚局部外用(yòng)制劑 Q3 中(zhōng)的 CQA、IVRT 和 IVPT 的評價方法進行了要點闡述。因皮膚外用(yòng)制劑又(yòu)可(kě) 以細分(fēn)為(wèi)軟膏、凝膠、乳膏、乳液、溶液等，制劑 的主體(tǐ)基質(zhì)、處方組成與劑型相關聯。Q3 的相關 特性表征、CQA 研究、IVRT 和 IVPT 也會具(jù)有(yǒu)劑 型特性。在後續報道中(zhōng)将以案例的形式更加個性化 地進行分(fēn)析和介紹。
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